Układ oksytocyna-oksytocynaza
Pierwszym syntetycznie uzyskanym hormonem peptydowym była oksytocyna, która ulega inaktywacji przez zawartą we krwi kobiet ciężarnych oksytocynazę. Szybko więc uznano, że enzym ten zapobiega poronieniom i przedwczesnym porodom. Tymczasem w miarę rozwoju ciąży pomimo stałego wzrostu stężenia tego enzymu we krwi matki nie tylko znajduje się stale obok niego oksytocyna, ale im bliżej porodu — tym mniejsze jej dawki wyzwalają skurcze macicy. Dopiero łączne rozpatrywanie oksytocyny i oksytocynazy jako jednego, nierozerwalnego układu wyjaśniło te pozorne sprzeczności już w początku lat 60-tych. R. Klimek opisał układ oksytocyna-oksytocynaza kiedy w położnictwie lansowano "blok progesteronowy" Csapo, a z hormonów podwzgórzowych (dawniej zwanych "tylnego płata przysadki") znano budowę tylko oksytocyny i wazopresyny. Obecnie nie tylko dokładnie poznano pozostałe hormony podwzgórzowe i ich związki z prostaglandynami i cytokinami, ale opisano też nowy układ: kortykorelina-białko wiążące kortykorelinę 9,10.
Pod wpływem ciążowego powiększania się jamy macicy podwzgórze matki produkuje coraz większe ilości hormonów, co z kolei indukuje w łożysku zwiększoną syntezę oksytocynazy, by zapobiec osiągnięciu przez hormon we krwi poziomu mogącego wyzwolić skurcze macicy. Także wzrastający płód dodatkowo indukuje produkcję oksytocynazy przez wydzielanie własnej oksytocyny i pozostałych hormonów podwzgórzowych. Wszystko to dzieje się w zgodnym oddziaływaniu matki, płodu i łożyska, a nawet błon płodowych w jednym czasoprzestrzennym procesie zwanym ciążą. Z trzech wymienionych komponentów tylko łożysko charakteryzuje się zaprogramowaną przeżywalnością w określonym przez płód i matkę czasie. Kiedy jego zdolności adaptacyjne zanikają, produkcja oksytocynazy nie nadąża za już stale wzrastającą jej hormonalną indukcją, albo wręcz nawet spada.
W końcu ciąży produkcja oksytocyny jest największa i wystarcza do stymulacji czynności porodowej macicy. Wcześniejsze zmniejszenie syntezy rozkładającego ją enzymu nie wymaga więc dodatkowej produkcji hormonu, która jest wystarczająca, a tylko ulega inaktywacji w fizjologicznych warunkach. Przy łożysku w pełni wydolnym nawet duże dawki oksytocyny nie są w stanie zakończyć ciąży, ponieważ natychmiast zwiększa się synteza oksytocynazy do potencjalnych możliwości łożyska, co R.Klimek nazwał "blokiem enzymatycznym". Blok ten reguluje też wydzielanie CRH (cortycotrophin releasing hormone), który jest 41-aminokwasowym peptydem stymulującym wydzielanie ACTH. U człowieka stwierdza się 50-krotny wzrost jego poziomu we krwi ciężarnych w 3. trymestrze ciąży, czemu towarzyszy zwiększenie stężenia glikokortykoidów i estrogenów.
Przysadka płodu produkuje ACTH od 7.-8. tygodnia ciąży, kiedy równocześnie trofoblast wytwarza CRH. Ten ostatni we krwi matki wzrasta gwałtownie do 20 razy w ostatnich 6-8 tygodniach ciąży. Od stanu tych hormonów zależy też synteza prostaglandyn, oksytocyny i cytokin, co autorzy różnych teorii utrzymania ciąży i początku porodu usiłują zintegrować posługując się tylko istnieniem sprzężeń zwrotnych. Dokładnie nawet opisują enzymy jako konieczne elementy do każdej kolejnej przemiany w sterydogenezie, ale przy klinicznej ocenie działalności tych hormonów zupełnie je pomijają. Tymczasem zmiana stężenia enzymu jako katalizatora ma nieporównywalnie większe znaczenie od analogicznej w swym zakresie różnicy w poziomie każdego hormonu.
Oksytocynazy — najważniejsze markery w ciąży
Najbardziej istotne są enzymy regulujące fizjologiczne procesy, z których oksytocynaza reprezentująca aminopeptydazy ma znacznie szersze działanie niż wynika to z jej nazwy, ponieważ reguluje także poziom aminopeptydowych hormonów podwzgórzowych. Tym samym decyduje o funkcjonowaniu neuro-, endo- i immunoregulacji całej sterydogenezy.
Enzymy te są bardzo stałe, o bardzo małym stopniu zmienności ich aktywności i wysokiej powtarzalności w oznaczeniach, ponieważ są indukowane przez neuropeptydy działające w mikrogramowych dawkach. Głównym źródłem ich produkcji w ciąży jest łożysko, ale ich synteza zależy nie tylko od stopnia indukcji, ale równocześnie od ogólnej wydolności łożyska, w tym także odbywającej się w nim sterydogenezy, będącej pośrednio pod kontrolą neurohormonów. Ograniczenie więc syntezy inaktywujących je enzymów wystarcza do zapoczątkowania akcji skurczowej macicy.
Od kilkudziesięciu lat wielokrotnie udowodniono, że wzrastający poziom izooksytocynazy oznacza prawidłowy rozwój ciąży, a jego zwolnienie, nie mówiąc już o obniżeniu, pozwala na przewidywanie zbliżającego się porodu. Najbardziej spektakularne jest zapobieganie przedwczesnym porodom przez zastosowanie ACTH-depot w wypadku zbyt wczesnego obniżania się enzymów. Niski bowiem poziom aminopeptydaz jest niczym innym jak tylko wskaźnikiem obniżenia indukowanego przez kortykorelinę ich poziomu. Wyrównanie sterydogenezy poprawia czynność łożyska, podnosi w nim produkcję kortykoreliny i w konsekwencji także oksytocynazy. Należy przy tym uwzględnić też sprawcze działanie czasu rozwojowego płodu, by ostatecznie w postępowaniu klinicznym opierać się nie na teoretycznych rozważaniach, lecz na sprawdzonych markerach rozwoju ciąży.
Monitorowanie enzymatyczne ciąży
Ogólny stan ciężarnej i doświadczenie położnika najlepiej obecnie są obiektywizowane przez wyniki badań ultrasonograficznych i enzymatycznych, ale pod warunkiem ich podporządkowania rozwojowemu, a nie kalendarzowemu czasowi trwania ciąży. Normy bowiem ultrasonograficzne w większości podręczników dotyczą przeciętnych wymiarów płodów, a nie noworodków we właściwych dla nich aktualnych i docelowych tygodniach porodowych. Natomiast przy oznaczeniach oksytocynazy nie docenia się w laboratoriach rygorystycznego przestrzegania wartości pH, które decydują o odróżnianiu aktywności oksytocynazy (CAP 1 ) od izooksytocynazy (CAP 2 ).
Przy dostatecznym doświadczeniu klinicysta potrafi na podstawie stanu ciąży ocenić, czy otrzymywane wyniki laboratoryjne są poprawne, ponieważ tak bardzo stabilny jest poziom oksytocynaz, enzymów bezpośrednio związanych z neuroendokrynną regulacją ustroju w najważniejszym okresie życia każdej kobiety, jakim jest ciąża.Od kilkudziesięciu lat zwraca w nich uwagę stałość uzyskiwanych wyników w różnych sytuacjach klinicznych, które wzbogacone postępem wiedzy i technologii pozwalają na otwieranie wciąż nowych horyzontów diagnostyczno-terapeutycznych w tak naturalnym przecież położnictwie. Z istoty powstania, istnienia i rozwoju płodu wynika, że tylko enzymy jako markery biochemiczne mieszczą się w pełnym zakresie żywego układu matka-płód. co potwierdzono aktualnymi wynikami monitorowania 209 kolejnych ciąż ryzykownych u kobiet po leczeniu niepłodności11-13 . Ciężarne, u których poród zakończył się fizjologicznie w porównaniu do pacjentek z rozpoczętym samoistnie, ale ukończonym przez cięcie cesarskie porodem (32% przypadków), były statystycznie znamiennie młodsze (p<0,005), ich ciąże trwały dłużej (p<0,02), a noworodki z nich urodzone były dłuższe (p<0,05). Aktywność oksytocynazy, jak i izooksytocynazy w surowicy w ciągu ostatnich 10 tygodni ciąży była wyższa (p<0,05), a wyrównanie poziomu obu enzymów nastąpiło w 39. dniu przed porodem na niższym poziomie (p<0,05). Przedporodowe bowiem poziomy badanych izoenzymów zależą od czasu zrównania ich poziomów w ciąży.
Po raz pierwszy też sprawdziliśmy możliwość rozróżniania poziomów przedporodowych oksytocynazy (CAP 1 ) i izooksytocynazy (CAP 2 ) w zależności od wartości wskaźnika dojrzałości K. Poziomy te są najniższe u dojrzałych noworodków ze wskaźnikiem K 6,4±1,0 co odróżnia je od noworodków z ustabilizowanymi enzymami przy wartościach wskaźnika K=8 pkt.
Dojrzałość płodowa noworodków, podobnie jak ich masa i długość, zgodnie z prawami auksologii, są statystycznie znamiennie skorelowane z wiekiem płodowym15 . Stwierdziliśmy zgodność uzyskiwanych wyników prognozowania w zależności od uwzględniania komponenty enzymatycznej metody M.Klimka, w której ostateczne wyniki zależą od postępowań położniczych14,15 . Masa i dojrzałość noworodka prognozowana przez komputer z udziałem lub pominięciem badań enzymatycznych dają wyniki identyczne przy czym wartości rzeczywiste zależą od rodzaju rozpoczęcia porodu. W porodach spontanicznych są niższe od porodów indukowanych, ale równocześnie wyższe od rozwiązań elektywnym cięciem cesarskim.
Zrozumienie samej istoty enzymatycznego monitorowania pociąga za sobą automatycznie konieczność zmiany poglądów na temat indywidualnego terminu porodu i tym samym nowoczesnego postępowania z każdą ciężarną, nawet jeśli nie można u niej dokonywać nowoczesnej diagnostyki. Potwierdzeniem tego są poprawiające się wyniki perinatologiczne w oddziałach szpitalnych, w których nawet wykonanie tych badań w ograniczonym zakresie przyczynić się może do znacznego polepszenia opieki perinatologicznej przez ustalenie wskazań do hormonalnej terapii i ocenę udziału enzymów w utrzymywaniu płodowych kanałów rozwojowych. Docelowe wartości enzymów są jednakowe niezależnie od stopnia zmienności kanału wzrostu, pod warunkiem jednak, że zachowanie się profilów oksytocynazy jest wskazaniem do substytucyjnej adrenokortykoterapii i przedłużonym działaniu. Kobiety ze zmiennym profilem statystycznie znamiennie częściej wymagały tej terapii, tak w stosunku do zmiany jednego jak i dwóch kanałów (p<0,01). Zwracają uwagę wyższe poziomy enzymów u ciężarnych nie wymagających ACTH-terapii, u których ciąża trwa dłużej i kończy się z większą masą i długością ciała urodzonych noworodków.
Po raz pierwszy stwierdziliśmy wcześniejsze wyrównanie poziomu izooksytocynaz o 9 dni w porównaniu z kobietami również po leczeniu niepłodności, ale nie otrzymujących tej terapii. Oznacza to, że przyczynowa terapia substytucyjna kortykotropiną o przedłużonym działaniu już we wczesnej ciąży wykazuje normalizację jej stanu.
Zakończenie
Podstawowym kryterium jakiegokolwiek testu klinicznego jest jego powtarzalność nie tylko laboratoryjna, ale przede wszystkim medyczna. Lekarza najbardziej interesuje stan kliniczny badanej osoby, sam bowiem musi przewidywać granicę wartości zlecanych oznaczeń zanim pobierze materiał i prześle do badania. Lekarz na podstawie znajomości klinicznej stanu badanych ciężarnych może i powinien kontrolować także poprawność metodyczną oznaczeń. Otrzymanie kilku lub kilkunastu wyników laboratoryjnych w jednym dniu pozwala zestawić aktualne wyniki z dotychczasowymi poziomami oksytocynazemii. Jeśli wszystkie wyniki wykazują odchylenia w jednym kierunku, proporcjonalnie do ich bezwzględnych wartości, najczęściej mamy do czynienia ze zmianą pH roztworu enzymu w okresie inkubacji i/lub jej skrócenia, a co częściej się zdarza — także przedłużenia jej nawet o kilka minut.
Poziomy oksytocynazy i izooksytocynazy w przypadkach cukrzycy, nadciśnienia, neurohormonalnych gestoz oraz kobiet ciężarnych wymagających leczenia adreno-kortykotropiną są statystycznie znamiennie niższe od analogicznych wartości u osób zdrowych. Zwraca też szczególną uwagę brak dostatecznego wzrostu oksytocynazemii i izooksytocynazemii u tych kobiet, u których ciąże wymagały interwencji położniczej, tokolizy lub zastosowania oksytocyny, czy też prowokowania i/lub wspomagania porodu.
Olbrzymią zaletą oksytocynaz jest ich stabilność in vitro w temperaturze pokojowej nawet przez kilkanaście dni oraz minimalne fluktuacje poziomu nie przekraczające w warunkach fizjologicznych 2-3% oznaczanej aktywności enzymatycznej. Surowica krwi nie traci znacząco aktywności oksytocynazowej nawet wówczas gdy jest przetrzymywana przez 24 godziny w temperaturze 37°C w zakresie pH od 6 do 10.
W razie konieczności szybszego uzyskania wyników, można skrócić czas inkubacji o połowę. Należy oznaczać obydwa izoenzymy (CAP 1 i CAP 2 ), ponieważ oprócz informacji przydatnej klinicznie kontroluje się metodykę oznaczeń. Optima pH roztworów inkubacyjnych są tak dobrane, że jakiekolwiek odchylenie w ich wartościach prowadzi do zaniżenia aktywności CAP 1 , a podwyższenia CAP 2.
Wreszcie sami lekarze muszą wskazać laborantom metodykę badań, ponieważ już twórcy metody H. Tuppy i H. Nesvadba opublikowali błędnie stężenie NaNO2 , a prawie wszystkie tłumaczenia mylą prawidłowy sulfaminian amonu z pospolitym siarczanem, co uniemożliwia oznaczenie. Wystarczy tylko przekazać do pracowni poprawną metodykę laboratoryjną, od kilkudziesięciu lat niezmiennie przez nas stosowaną i najlepszą.
Oznaczanie oksytocynazemii
Odczynniki:
1. substrat - 135 mg dwuchlorowodorku L-cystyno-dwu-b-naf-tylamidu rozpuscić w 50 ml 0,012 N HCl i dopełnić do 100 ml wodą destylowaną;
2. bufor do CAP 1 : 2,07 g weronalanu sodu rozpuścić w kolbie miarowej i dopełnić do 100 ml wodą podwójnie destylowaną (wolna od CO 2 ). Do 68,9 ml weronalu sodu dodać 31,1 ml 0,1 N HCl i 50 ml podwójnie destylowanej wody - otrzymuje się bufor o pH 7,9;
3. bufor do CAP 2: : A. 3,6312g KH 2 PO 4 rozpuścić w 400 ml wody destylowanej: B. 2,386g Na2HPO4 x 12 H2O rozpu-.Enzymatyczna... 47 ścić w 100 ml wody destylowanej. 400 ml składnika A dodać do 100 ml składnika B, co pozwala uzyskać pH 6,24.
4. 10% roztwór kwasu trójchlooctowego;
5. 0,1% roztwór NaNO 2 ; 6. 0,5% sulfaminianu amonu;
6. 0,1% roztwór dwuchlorowodorku N-(1-naftyl)-etylenodwuaminy;
7. mieszanka acetonowa (dwie objętości 0,36 N HCl i jedna objętość acetonu).
Wykonanie oznaczenia:
Do probówek wirówkowych kolejno odmierzyć:
1. 0,15 ml H2O destylowanej;
2. 0,5 ml buforu pH 7,9;
3. 0,1 ml surowicy badanej; dokładnie wymieszać i dodać 0,25 ml substratu, wymieszać. Probówki wstawia się do termostatu o temperaturze 37°C na 2 godziny, po czym reakcja zostaje przerwana przez dodanie 1 ml 10% roztworu kwasu trójchlooctowego, miesza się i wiruje. Po odwirowaniu odpipetować 0,5 ml płynu znad osadu, następnie do 100 ml kolbki Erlenmayera zawierającej 2,5 ml mieszanki acetonowej.
Dalsze postępowanie przeprowadza się w ciemni: dobrze mieszając zawartość w kolbce dodaje się w odstępach 3-minutowych: 0,5 ml NaNO2 , 0,5 ml sulfaminianu amonu i 0,5 ml etylenodwuaminy, po czym roztwór wstawia się do termostatu o temperaturze 37°C na 2 godziny. Gęstość optyczną mierzy się w spektrofotometrze przy długości fali 565 nm wobec ślepej próby (2,5 ml mieszanki, 0,5 ml NaNO2 , 0,5 ml sulfaminianu amonu i 0,5 ml etylenodwuaminy). Powyższa modyfikacja w stosunku do oryginalnej metody cechuje się skróceniem inkubacji do 2 godzin, co okazało się zupełnie wystarczające, oraz ograniczeniem ilości mieszanki acetonowej z 9 ml do 2,5 ml. Przy odpowiednim doświadczeniu dla rutynowych badań klinicznych, ale nie dla doświadczalnych, można pominąć wykonywanie ślepej próby dla każdego oznaczenia. Jest ono konieczne u ciężarnych otrzymujących sulfonamidy lub nitrofurantoinę. Nie zwiększa to prawie wcale błędu metody. Krzywą standardową wykreśla się przez rozpuszczenie ß-naftyloaminy w mieszance acetonu z HCl.
Prosta metodyka oznaczania oksytocynazemii pozwala na:
1. zwiększenie do właściwych średnich czasu trwania ciąży w każdym szpitalu.
2. ograniczenie do minimum porodów indukowanych i operacyjnych.
3. zmniejszenie do 1/3 koniecznych transfuzji krwi19,20.
Przede wszystkim zaś nie zamienia się fizjologicznej ciąży na jatrogenne procedury położnicze zgodnie z zasadą primum non nocere, przybliżając położnictwo do poziomu pozostałych dziedzin medycyny, obecnie już nie wyobrażalnych bez stosowania hormonów podwzgórzowych i ich analogów oraz wykorzystywania diagnostyki i monitorowania enzymatycznego.
Piśmiennictwo:
1 Klimek R.: Gin. Pol., 1963, 34, 289.
2 Klimek R.:Gin. Pol., 1963, 34, 473.
3 Klimek R.: Folia. Med. Cracoviensia, 1964, 6, 471.
4 Klimek R.: Enzymatic and Ultrasonographic Monitoring of Pregnancy and Prediction of Birth-date, EAGO ISPPM, Cracow, 1992.
5 Klimek. R.: Enzymatyczne monitorowanie ciąży, EAGO - Polish Branch ISPPM, Kraków, 1991.
6 Klimek R.: Monitoring of Pregnancy and Prediction of Birth-date, Parthenon Publ. Group. London New York, 1994.
7 Klimek R.: Pol. Tyg. Lek., 1962, 17, 2001.
8 Klimek R. (red.): Położnictwo, PZWL Warszawa, 1988.
9 Bałajewicz M. i wsp.: Medipress Gin. Poł., 1996, supl. 4, 15.
10 Klimek R., Pabian W., Klimek M.: Medipress Gin. Poł., 1996, vol. 2, no. 1, 2-7.
11 Bałajewicz M., Górecki T., Kołacz M.: Klin. Perinat. i Gin., 1999 (w druku).
12 Górecki T., Milewicz T., Tomaszewska B.: Klin. Perinat. i Gin., 1999.
13 Klimek M., Tomaszewska B., Żabińska-Popiela M.: Klin. Perinat. i Gin., 1999.
14 Szymański W. (red.): Położnictwo Rudolfa Klimka, DREAM, Publ. Comp., Inc., Kraków, 1999.
15 Klimek M.: Prognoza terminu porodu i stan noworodka, DREAM Publ. Comp., Inc., Kraków, 1994.
16. Morgunova E., Tuuttila A., Bergmann U. et al.: Science, 1999, 284, 1667-1670.
17. Van Meir CA. i wsp.: Placenta, 1996, 17, 291.
Enzymatyczna diagnostyka ginekologiczno- położnicza
Pociążowe neuroendokrynne
zespoły chorobowe i nowotwory
O programie prognozującym
Udostepnianie i sprzedaż programu